การออกแบบ

วัคซีนดีเอ็นเอก่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันได้ดีสุดเมื่อใช้พาหะพันธุกรรมชนิดที่เซลล์แสดงออกเป็นโปรตีนได้จำนวนมากที่สุดปกติจะเป็นพลาสมิดอันประกอบด้วยส่วน viral promoter ที่ดีซึ่งขับการถอดรหัสและการแปลรหัสยีน (หรือ complementary DNA) ที่ต้องการ[17]โดยอาจรวมส่วน Intron A (Interferon alfa-2b) เข้าด้วยเพื่อเพิ่มเสถียรภาพของเอ็มอาร์เอ็นเอแล้วเพิ่มการแสดงออกของโปรตีน[18]อนึ่ง ยังอาจรวมเอาส่วน termination signal หรือ polyadenylation ที่ขับการแสดงออกโปรตีนได้ดี เช่น ฮอร์โมนควบคุมการเจริญเติบโตของวัว (bovine growth hormone) หรือ beta globulin ของกระต่าย[6][7][19]พาหะซึ่งมียีนหลายยีนที่ต้องการซึ่งเรียกว่า polycistronic vector บางครั้งจะทำขึ้นเพื่อให้แสดงออกอิมมูโนเจนมากกว่าหนึ่งอย่าง หรือให้แสดงออกอิมมูโนเจนบวกกับโปรตีนร่วมกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (immunostimulatory protein)[20]

เพราะพลาสมิดสามารถบรรจุรหัสพันธุกรรมได้เพียง ~200 Kbp การออกแบบให้สามารถแสดงออกโปรตีนได้ดีสุดจึงจำเป็น[20]วิธีหนึ่งก็คือปรับใช้โคดอนภายในเอ็มอาร์เอ็นเอของจุลชีพก่อโรคให้ได้ดีสุดสำหรับเซลล์ยูแคริโอตคือ จุลชีพก่อโรคมักมี GC-content (guanine-cytosine content) ในอัตราที่ต่างกับสิ่งมีชีวิตที่เป็นเป้า ดังนั้น การเปลี่ยนลำดับยีนของอิมมูโนเจนให้มีโคดอนเหมือนกับที่มักเกิดในสิ่งมีชีวิตอาจทำให้แสดงออกโปรตีนได้ดีกว่า[21]

ประเด็นที่ต้องพิจารณาอีกอย่างก็คือการเลือกลำดับ promoterนักวิทยาศาสตร์ได้ใช้ลำดับยีนที่เรียกว่า SV40 promoter ที่อาจก่อเนื้องอกในลิงและมนุษย์ จนกระทั่งพบว่าส่วน promoter จากไวรัสก่อมะเร็งไก่ คือ Rous Sarcoma Virus มีอัตราการแสดงออกที่สูงกว่า[6]ต่อมาไม่นานนี้จึงพบว่า สามารถเพิ่มอัตราการแสดงออกและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในสัตว์ตัวแบบโดยใช้ส่วน immediate-early (MIE) promoter ของซัยโตเมกาโลไวรัส (CMV) และใช้ cis-acting transcriptional element (หรือ cis-regulatory element) จากรีโทรไวรัส (retrovirus)[22]วิธีเพิ่มอัตราการแสดงออกของโปรตีนอื่น ๆ รวมทั้งการการแทรกลำดับ enhancer sequence, อินทรอนสังเคราะห์ (synthetic introns), ลำดับ tripartite leader (TPL) จากอะดีโนไวรัส และการเปลี่ยนปรับปรุงส่วน polyadenylation และ termination signal[6]ตัวอย่างพลาสมิดสำหรับวัคซีนดีเอ็นเออย่างหนึ่งก็คือ pVAC (ของบริษัท InvivoGen) ซึ่งใช้ส่วน SV40 promoter

ความไม่เสถียรภาพของโครงสร้างดีเอ็นเอเป็นปัญหาสำคัญสำหรับผู้ผลิตพลาสมิด ของการฉีดวัคซีนดีเอ็นเอ และของการบำบัดด้วยยีน[23]ส่วนต่าง ๆ ที่เป็นแกนหลัก (backbone) ของพลาสมิดอาจมีส่วนในการสร้างความไม่เสถียรภาพรูปแบบลำดับยีนอันก่อความไม่เสถียรภาพที่รู้แล้วรวมทั้ง direct repeat, inverted repeat, tandem repeat ซึ่งพบใน cloning vector และ expression vector ที่มีขายทั่วไปดังนั้น การลดหรือการกำจัดลำดับยีนภายในแกนหลักของพลาสมิดที่ไม่เข้ารหัสโปรตีนและไม่จำเป็น ก็จะลดโอกาสเกิดความไม่เสถียรภาพโดยตรง และดังนั้น ลดโอกาสการเกิดยีนรวมกันใหม่เนื่องกับพลาสมิด[24]

กลไกของพลาสมิด

เมื่อพลาสมิดเข้าไปในนิวเคลียสของเซลล์แล้ว มันก็จะถอดรหัสเป็นเพปไทด์ซึ่งเป็นแอนติเจนแปลกปลอมโมเลกุลคอมเพล็กซ์ major histocompatibility complex (MHC) ทั้ง class I และ II ของเซลล์ก็จะนำแอนติเจนไปแสดงที่ผิวเซลล์เซลล์ที่แสดงแอนติเจน (antigen-presenting cell) ก็จะเคลื่อนย้ายไปยังต่อมน้ำเหลือง แล้วแสดงแอนติเจนและโมเลกุลที่ช่วยกระตุ้น เป็นการส่งสัญญาณให้กับเซลล์ที แล้วเริ่มการตอบสนองของภูมิต้านทาน[25]

รูปแบบโปรตีน/ดีเอ็นเอ

สารอิมมูโนเจนสามารถส่งเข้าไปยังส่วนโดยเฉพาะ ๆ ของเซลล์เพื่อเพิ่มการตอบสนองของแอนติบอดีหรือของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์ (cytotoxic T-cell)แอนติเจนที่หลั่งออกหรือยึดอยู่กับเยื่อหุ้มเซลล์จะกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีได้ดีกว่าแอนติเจนที่อยู่ในไซโทซอล การตอบสนองของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์อาจเพิ่มได้โดยปรับให้แอนติเจนสลายตัวในไซโทพลาซึมแล้วเข้าสู่กระบวนการส่งแอนติเจนไปที่ผิวเซลล์ของ major histocompatibility complex (MHC) class I[7]ซึ่งปกติทำโดยเพิ่มยูบิควิติน (ubiquitin) ไปที่ยีนโปรตีนด้านเอ็น-เทอร์มินัส[26][27][28]

คอนฟอร์เมชันของโปรตีนยังมีผลต่อการตอบสนองของแอนติบอดีอีกด้วยโครงสร้างที่เป็นระเบียบ (เช่น อนุภาคไวรัส) ได้ผลดีกว่าโครงสร้างอันไม่มีระเบียบ[29]มินิยีน (หรือ MHC class I epitopes) จากจุลชีพก่อโรคชนิดต่าง ๆ สามารถเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์เพื่อต่อต้านจุลชีพก่อโรคบางชนิด โดยเฉพาะเมื่อรวม epitope ชนิด TH เข้าไปด้วย[7]